Kamis, 15 Oktober 2009

Glycine N-methyltransfrerase adalah contoh dari keanekaragaman hayati fungsional

Glycine N-methyltransfrerase adalah contoh dari keanekaragaman hayati fungsional
Polycyclic aromatic hydrocarbon seperti B [a] P1, 3-methylcholanthrene, dan TCDD adalah polutan lingkungan yang mendatangkan berbagai racun, teratogenic, dan karsinogenik tanggapan dalam terekspos hewan. Selain itu, bahan ini adalah inducers ampuh biotransformation tertentu reaksi-reaksi yang dikatalisis oleh sitokrom P-450-tergantung monooxygenases, keluarga super isozymic hemoproteins terdiri dari lebih dari 12 kelompok gen. Isozymes ini menampilkan kekhususan luas dan memetabolisme substrat endogen baik substrat dan xenobiotics untuk elektrofilik derivatif, beberapa di antaranya dapat berinteraksi dengan DNA, sehingga berpotensi protooncogenes mengaktifkan atau menonaktifkan gen supresor tumor. Bukti yang telah dipublikasikan menunjukkan bahwa tikus induksi CYP1A1 setelah pengobatan dengan PAHs, seperti B [a] P atau B [e] P, mungkin memerlukan reseptor-Ah jalur independen dimediasi oleh protein reseptor cytosolic lain, 4 S PAH - binding protein . Baik Ah reseptor dan 4 S PAH-binding protein mengikat ligan berbeda menunjukkan kekhususan, dengan 3-methylcholanthrene berinteraksi dengan keduanya. 4 S protein yang telah dimurnikan untuk homogenitas menggunakan kromatografi serangkaian langkah, melibatkan pertukaran ion, gel perembesan, interaksi hidrofobik, dan afinitas chromatographies. Parsial sequencing dari 33-kDa protein 4 S menunjukkan identitasnya sebagai GNMT (S-adenosylmethionine: glycineN-methyltransferase, EC 2.1.1.20). Berdasarkan sejumlah kriteria, GNMT dan 4 S PAH-binding protein diperlihatkan untuk menjadi satu dan protein yang sama (34). Diperkirakan bahwa enzim ini dapat hadir dalam konsentrasi tinggi dalam hati tikus dan manusia. Meskipun tingkat tinggi protein ini dalam jaringan manusia, peran fisiologis GNMT tidak dipahami dengan baik.
BAHAN DAN METODE
Kimia - Kultur jaringan media, α-minimal esensial media, serum janin sapi, gentamycin, geneticin dan Lipofectin tersebut dibeli dari Life Technologies, Inc Kode sumber dari bahan-bahan lain: [α-32P] dATP dari ICN biokimia (Irvine , CA) [3H] B [a] P (60 Ci / mmol) dari Amersham Corp [3H] TCDD (41 Ci / mmol) dari Chem-Syn Science Labs (Lenexa, KS) Immobilon P dari Millipore ( Bedford, MA) mentransfer membran dari Schleicher & Schuell (Keene, NH) BM Chemiluminescence blotting Barat kit dari Boehringer Mannheim Biochemica Corp (Indianapolis, IN) Tris, TEMED, Tween 20, B [a] P, B [ e] P, 3-methylcholanthrene, TCDD, Isositrat dehidrogenase, nikotinamida, ethoxyresorufin, dan resorufin dari Sigma. Afinitas-dimurnikan antibodi terhadap Ah GNMT dan reseptor itu murah hati hadiah dari Dr Conrad Wagner (Vanderbilt University) dan Dr Bill Greenlee (University of Massachusetts Medical Center), masing-masing. Ah reseptor yang mengandung plasmid cDNA ini baik yang disediakan oleh Dr Chris Bradfield (University of Wisconsin).
Kebudayaan sel - D422 yang CHO sel, sebagian kekurangan phosphoribosyl adenin transferase, pada awalnya terisolasi setelah mutagenesis oleh SIB seleksi atas dasar perlawanan parsial ke ADP. Garis sel ini telah digunakan oleh kami untuk beberapa tahun di transfection dan perbaikan DNA studi. Budaya saham tetap dipertahankan pada 37 ° C dalam suasana 95% udara dan 5% CO2 dalam medium minimal esensial, dilengkapi dengan 40 mg / l prolin yang mengandung 50 μg / ml gentamycin dan 10% serum janin sapi betis. Mouse garis sel hepatoma, HEPA-1, yang digunakan sebagai kontrol positif dalam percobaan yang mengikat XRE, adalah berbudaya dan dipelihara seperti yang dijelaskan.
Konstruksi plasmid dan transfection - The GNMT cDNA ini disintesis oleh RT-PCR metodologi dari hati tikus poli (A) + RNA persiapan. GNMT spesifik yang maju dan reverse primer adalah masing-masing. Produk ini selanjutnya dimurnikan dengan gel agarosa electophoresis, dan urutan ini ditunjukkan untuk menjadi identik dengan diterbitkan GNMT cDNA . Dua kloning NheI andXhoI situs untuk dimasukkan ke dalam daerah di noncoding cDNA GNMT oleh metodologi PCR. Yang disucikan DNA beruntai ganda Produk ini diligasi ke NheI / XhoI-dicerna pMAMneo (CLONTECH, Palo Alto, CA). Plasmid membangun, pMAMneo / GNMT, berisi GNMT masukkan dari ukuran yang sesuai dalam arti orientasi seperti yang ditentukan oleh urutan pembatasan pencernaan dan tekad. pMAMneo / GNMT adalah transfected ke sel CHO oleh metode Lipofectin. Secara singkat, pada hari 0, 10 μg DNA dalam 100 μl of Opti-MEM aku dicampur dengan 15 μl dari Lipofectin reagen, dilapisi ke sekitar 2 × 105 sel dalam 2 ml serum pertumbuhan bebas menengah, dan diinkubasi selama 24 jam pada 37 ° C dalam inkubator CO2. DNS transfectants didirikan menggunakan DNA dari plasmid pMAMneo orangtua.
Binding assay untuk Spesifik B [a] P dan TCDD - Aktivitas mengikat tertentu dinilai oleh gradien sukrosa analisis seperti yang dijelaskan sebelumnya . Secara singkat, 100.000 × g supernatant fraksi (0,5-1 mg protein) telah diinkubasi dengan 10 nm [3H] B [a] P atau [3H] TCDD selama 1 jam pada 4 ° C dan 2 jam pada suhu kamar, masing-masing, dengan atau tanpa kelebihan 200-kali lipat dari unlabeled ligan. pecahan drop dikumpulkan dan diuji untuk radioaktivitas dalam suatu cairan kilau spektrometer.
Northern Blot Analisis - RNA diisolasi dari transfected secara stabil klon oleh SPEC ULTRA sistem isolasi RNA dari Biotecx. Total RNA sampel (~ 40 μg) yang didenaturasi dengan pemanasan pada 65 ° C selama 15 menit di 50% (v / v) formamide, 2,2 m formaldehida, 0.5 × berjalan buffer dan fractionated oleh elektroforesis melalui mengandung formalin 1,5% gel agarosa . Sampel RNA ditransfer semalam . Setelah hibridisasi, membran dicuci dan terpapar x-ray film (Xar-5, Eastman Kodak Co) pada -80 ° C dalam semalam.
EROD Assay - Sel CHO tumbuh 80-90% confluency ditantang dengan 4 μm B [a] P selama 4 jam Sel-sel disapu dengan dingin es fosfat-buffer salin, resuspended di 20 mm Tris, pH 7,8, dan homogen dalam segelas Homogenizer.
Gel Mobility Shift Assay (GMSA) - Selular cytosolic ekstrak untuk GMSA dipersiapkan dengan metode Shapiro et al. (52), diikuti oleh pengobatan dengan 10 nm TCDD selama 3 jam pada suhu kamar in vitro. Ekstrak nuklir telah disiapkan dari sel yang telah diperlakukan dengan 2 nm TCDD selama 90 menit pada 37 ° C pada dasarnya seperti yang dijelaskan oleh Probst et al. (53). Secara singkat, sel-sel dihentikan pada 10 mm HEPES, pH 7.5, selama 15 menit di atas es, sentrifugal, dalam 1 sel resuspended volume pelet ranjang (25 mm HEPES, pH 7.5, 2 mm EDTA, 1 mm dithiothreitol) dan terganggu dalam Dounce longgar Homogenizer. Setelah sentrifugasi dalam dingin selama 10 menit di 14.000 × g, pelet nuklir itu dalam 1 sel resuspended volume pelet ranjang, 0,4 m KCl dan bergoyang pada 4 ° C selama 30 menit. Setelah homogenisasi dalam Dounce ketat aparat, gliserol ini ditambahkan ke konsentrasi akhir 20% (v / v). Fraction nuklir diperoleh dengan sentrifugasi pada 180.000 × g selama 30 menit pada 4 ° C, dan dialyzed melawan supernatants sedang tidur.
HASIL
GNMT cDNA yang disisipkan hilir dari sebuah retrovirus enhancer dan promotor unsur dan hulu dari SV40 splicing dan polyadenylation situs. Sel CHO sebagian dipilih sebagai target untuk transformasi karena kurangnya ekspresi gen endogen GNMT dan efisiensi transfection dengan pMAMneo / GNMT menggunakan teknik Lipofectin. Penyaringan awal dilakukan oleh RT-PCR analisis dari klon G418-tahan untuk 4 S PAH-binding protein dan gen β-aktin ekspresi. Data dengan Clone 6 dari CHO-GNMT (jalur 5), orangtua (jalur 2), dan CHO-neo (jalur 3) disajikan pada Gambar. 1. Kontrol positif, i.e. RNA dari hati tikus, akan ditampilkan dalam jalur 1. Hanya GNMT CHO-sel (di samping hati RNA) dipamerkan yang benar dipotong 4 S transkrip (jalur 5). Tidak ada sinyal yang diamati dengan baik CHO (jalur 2) atau sel CHO-neo (jalur 3). Terlebih, tidak ada sinyal positif diamati pada RNA diperoleh dari GNMT CHO-sel, ketika reaksi dilakukan dalam ketiadaan reverse transcriptase (jalur 4).
Analisis RT-PCR dari 4 S dan β-aktin transkrip dari sel CHO
Total selular RNA (0,5 μg) telah ditaklukkan kepada analisis RT-PCR selama 35 siklus dalam total volume 50 μl, seperti dijelaskan dalam teks. A 10-reaksi μl sampel dari orangtua CHO, CHO-neo, dan GNMT CHO-sel ini dielektroforesis pada 1,5% gel agarosa. 4 S dan β-aktin (β-A) mewakili 400 - dan 315-pasangan basa gen terpotong produk untuk 4 S dan β-aktin, masing-masing. Lane M, standar; jalur 1, RNA dari hati tikus; jalur 2, sel CHO RNA; jalur 3, CHO-neo RNA; jalur 4 dan 5, CHO-RNA sel GNMT diperkuat tanpa dan dengan reverse transcriptase, masing-masing.
Ekspresi GNMT (4 S protein) dalam GNMT CHO-Sel
Untuk menentukan secara langsung jika sel GNMT CHO-GNMT memproduksi protein, total protein selular denaturating dianalisis dengan elektroforesis gel, dan protein yang ditransfer ke membran dan meraba-raba nitroselulosa afinitas-disucikan dengan antibodi poliklonal GNMT. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2 (jalur b), CHO-sel GNMT mengungkapkan tingkat GNMT signifikan bila dibandingkan dengan tingkat tidak terdeteksi ada pada orang tua (jalur d) atau CHO-neo (jalur c) sel-sel.
Blot Western analisis dari total selular protein dari GNMT CHO-sel
Yang GNMT CHO-sel tumbuh hingga 95% confluency dan dicuci dengan es-dingin fosfat-buffer salin, dan lysates telah disiapkan. Sampel analisis dikenai immunoblot menggunakan dimurnikan afinitas antibodi-GNMT.Lane a, dimurnikan hati tikus GNMT (0,5 μg); jalur b-d, 50 μg CHO-GNMT, CHO-neo, dan orangtua sel CHO lysates, masing-masing. Standar protein ditunjukkan pada leftwith 33-kDa protein ditunjukkan oleh tanda panah.
Kepadatan sukrosa Analisis Gradient B [a] P dan TCDD Binding Kegiatan
Khusus B [a] P dan TCDD kegiatan mengikat ditentukan dalam berbagai sel CHO (Fig.3, A dan B). Signifikan B [a] P kegiatan mengikat diamati dengan ekstrak dari sel CHO-GNMT (jalur 3, Gambar. 3 A). Nilai-nilai ini dalam perjanjian dekat dengan 2,54 nm dan 530 fmol / mg protein diamati dengan sitosol hati tikus.
Analisis gradien densitas sukrosa B [a] P (A) dan TCDD (B) cytosolic CHO mengikat dengan protein.
The cytosolic protein (0,5-1 mg) telah diinkubasi dengan [3H] B [a] P (A) atau [3H] TCDD (B) selama 60 menit pada 4 ° C dan selama 2 jam pada suhu kamar, masing-masing. Reaksi campuran (100 μl) disentrifugasi ditempatkan pada 5-20% kepadatan gradien sukrosa dan dianalisis untuk mengikat ligan spesifik. A, kolom 1, sel CHO; kolom 2, CHO-sel neo; kolom 3, CHO-sel GNMT; kolom 4, CHO-sel GNMT ekstrak dan 200 kali lipat melebihi nonradioactive B [a] P. B, kolom 1, HEPA-1 sel ekstrak dan diberi label TCDD; kolom 2, CHO-sel GNMT ekstrak dan diberi label TCDD; kolom 3, HEPA-1 sel ekstrak, berlabel TCDD, dan 200-kali lipat melebihi nonradioactive dioxin. Tidak ada kegiatan mengikat TCDD diamati baik dalam CHO-neo atau orangtua ekstrak sel CHO (data tidak ditampilkan). TCDD spesifik kegiatan mengikat cytosolic ditetapkan dalam ekstrak dari kontrol positif, HEPA-1 sel hepatoma (jalur 1, Gambar. 3 B). Pada dasarnya tidak ada kegiatan mengikat TCDD diamati di ekstrak baik dari CHO-GNMT (jalur 2), CHO-neo (data tidak ditampilkan), atau orang tua CHO (data tidak ditampilkan) sel.
Induksi CYP1A1 di GNMT CHO-Sel oleh PAHs
The CHO-GNMT, CHO-neo, dan sel-sel CHO diperlakukan dengan B [a] P, B [e] P, 3-methylcholanthrene, atau TCDD selama 8 jam, setelah waktu total RNA sudah siap dan dianalisis pada formaldehida denaturing agarosa gel. RNA yang telah ditransfer ke membran nitroselulosa ini diselidiki dengan mouse secara bersamaan CYP1A1 dan cDNA β-aktin. (Gambar 4). Hanya B [a] P, B [e] P, dan 3-methylcholanthrene memicu respons positif mRNA CYP1A1 (jalur 2, 4, dan 6, masing-masing).
Blot utara analisis RNA dari sel CHO-GNMT diobati dengan CYP1A1 inducers berbeda
The GNMT CHO-sel tumbuh 90% confluency dan diperlakukan dengan 4 μmB [a] P, B [e] P, 3-methylcholanthrene, atau 0,1 μm TCDD selama 6 h; kontrol diperlakukan dengan kendaraan sendiri. Sampel RNA hibridisasi untuk β-aktin dan CYP1A1 probe seperti yang dijelaskan dalam legenda dengan Gambar. 1. Jalur 1, 3, 5, and7 mewakili CHO-sel GNMT diobati dengan kendaraan sendiri; jalur 2, 4, 6, dan 8 adalah CHO-sel GNMT diperlakukan dengan B [a] P, B [e] P, 3-methylcholanthrene , dan TCDD, masing-masing. β-aktin (βA di Panel B) dan CYP1A1 (1A1 di Panel A) sinyal ditunjukkan. Ukuran spidol untuk RNA yang dielektroforesis dan bernoda dengan ethidium bromida. Posisi untuk CYP1A1 mRNA, i.e. sekitar 3 kilobases (kb), seperti yang ditetapkan dari ukuran spidol, ditunjukkan dalam margin.
Ekspresi CYP1A1 Protein dan EROD Kegiatan dalam B [a] P-induced GNMT CHO-Sel
Whole cell lysates siap dari B [a] P-diinduksi, orangtua, CHO-neo, dan GNMT CHO-sel dan dianalisis pada gel SDS-denaturing untuk CYP1A1 protein. Para protein ditransfer electrolytically diselidiki dengan antibodi poliklonal terhadap protein CYP1A1. Hanya CHO-sel GNMT protein dalam CYP1A1 diungkapkan tanggapan ke B [a] P pengobatan (jalur 6). Tingkat CYP1A1 di hati dari kontrol (jalur 2) dan B [a] P-diperlakukan (jalur 1) tikus diindikasikan sebagai kontrol positif.
Analisis Blot Western CHO-sel GNMT diperlakukan dengan B [a] P
The CHO-sel GNMT diperlakukan dengan 4 μm B [a] P selama 6 h. Total selular protein (50 μg) dianalisis pada 8% SDS-Polyacrylamide gel, yang ditransfer ke Immobilon P membran, dan meraba-raba dengan CYP1A1 antibodi. Lane 1, hati microsomal fraksi (50 μg) dari B [a] P-tikus diperlakukan; jalur 2, total protein selular (50 μg) dari orang tua sel CHO; jalur 3 dan 4, total protein selular (50 μg) - dan B [a] P-diperlakukan neo CHO-sel; jalur 5 and6, total protein selular (50 μg) dari kendaraan-dan B [a] P-diperlakukan GNMT CHO-sel.
Aktivitas Reseptor dan GMSA untuk XRE1 Binding
The Ah reseptor adalah protein yang ditandai baik berpartisipasi dalam dioksin-dimediasi induksi CYP1A1 dengan cara mengikat XREs terkait withCYP1A1. Kehadiran atau ketiadaan Ah reseptor di CHO, CHO-neo, dan sel CHO-GNMT ditentukan oleh analisis Utara dan Barat. Tidak terdeteksi jumlah protein yang ditemukan di setiap sel-sel ini .Kurangnya aktivitas reseptor Ah dikonfirmasi oleh assay fungsional nuklir yang melibatkan translokasi dan mengikat XRE eksperimen dengan GNMT CHO-sel; HEPA-1 tikus sel hepatoma digunakan sebagai kontrol positif (Gambar 6).
Mobilitas gel shift assay (GMSA dari aktivitas di XRE mengikat GNMT CHO-sel.
GMSA dari HEPA-1 (sebagai kontrol positif) dan GNMT CHO-sel ini dilakukan dengan 100 dan 10 μg protein, masing-masing, untuk cytosolic dan ekstrak nuklir. The ekstrak yang diinkubasi dengan berlabel 32P-XRE (mewakili 20.000 cpm) di hadapan 10.000 kelebihan kali lipat. Posisi ensiklopedia XRE dan XRE-Ah reseptor kompleks yang ditampilkan. Lane 1, bebas XRE; jalur 2 and3, HEPA-1 cytosolic fraksi dalam ketiadaan dan kehadiran 200-kali lipat melebihi unlabeled XRE, masing-masing; jalur 4and 5, HEPA-1 ekstrak nuklir dalam ketiadaan dan kehadiran dari 200-kali lipat melebihi unlabeled XRE, masing-masing; jalur 6 dan 7, CHO cytosolic fraksi dalam ketiadaan dan kehadiran 200-kali lipat melebihi unlabeled XRE, masing-masing; jalur 8 dan 9, CHO ekstrak nuklir dalam ketiadaan dan kehadiran 200-kali lipat melebihi unlabeled XRE, masing-masing. Pembentukan reseptor XRE-Ah rumit juga dibuktikan dengan ekstrak nuklir dibuat dari HEPA-1 sel yang telah treatedin vivo dengan TCDD (jalur 4). Sekali lagi, tidak rumit seperti diamati dengan TCDD-CHO-GNMT diobati ekstrak nuklir.

Tidak ada komentar:

Poskan Komentar